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16.E: Regulación de la transcripción mediante efectos sobre las ARN polimerasas (Ejercicios) - Biología

16.E: Regulación de la transcripción mediante efectos sobre las ARN polimerasas (Ejercicios) - Biología


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16.1 La relación [RD] / [Ds] es la concentración de un represor hipotético (R) unido a su sitio específico en el ADN dividido por la concentración de ADN no unido, es decir, es la relación entre el ADN unido y el ADN libre. Cuando se grafican las [DR] / [Ds] medidas frente a la concentración de represor libre [R], la pendiente del gráfico mostró que la relación [DR] / [Ds] aumentaba linealmente en 60 por cada aumento de 1x10-11 M en [R]. ¿Cuál es la constante de unión Ks para la asociación del represor con su sitio específico?

16.2 Se investigó cuantitativamente la unión de la proteína TBP a un oligonucleótido dúplex corto marcado que contenía una caja TATA (la sonda). La siguiente tabla muestra la fracción de sonda total unida (columna 2) y la proporción de sonda unida a libre (columna 3) en función de [TBP]. Estos datos se proporcionan por cortesía de Rob Coleman y Frank Pugh.

[TBP]

Nuevo Méjico

0.10

0.040

0.042

0.20

0.16

0.19

0.30

0.33

0.5

0.40

0.44

0.78

0.50

0.52

1.1

0.70

0.62

1.6

1.0

0.71

2.45

2.0

0.83

4.88

3.0

0.87

6.69

5.0

0.93

14

10

0.97

32.3

20

0.99

99

Trace los datos de las dos medidas diferentes de sonda unida. Tenga en cuenta que dado que el denominador de la columna 2 es una constante, la relación entre la sonda ligada y la sonda total se estabilizará, mientras que la cantidad de sonda libre puede continuar disminuyendo al aumentar [TBP] y, por lo tanto, obtener un aumento continuo en la relación de la sonda ligada. para liberar la sonda.

¿Cuál es la constante de equilibrio para la unión de TBP a la caja TATA?

16.3 ¿Cuál es el destino de la laca represor después de que se une al inductor?

16.4 Cómo hace el laca represor prevenir la transcripción del lacaoperón?

Para las siguientes dos preguntas, imaginemos que mezcló cantidades crecientes de la proteína de unión al ADN llamada AP1 con una cantidad constante de un oligonucleótido dúplex marcado que contiene el sitio de unión (TGACTCA). Después de medir la fracción de ADN unido por AP1 (es decir, la ocupación fraccional) en función de [AP1], los datos se analizaron mediante análisis de regresión de mínimos cuadrados no lineal en una amplia gama de valores posibles para DG. El error asociado con el ajuste de cada uno de esos valores a los datos experimentales se muestra a continuación; cuanto mayor sea la varianza del ajuste, mayor será el error.

16.5 ¿Cuál es el valor más exacto de DG para la unión de AP1 a este oligonucleótido dúplex?

16.6 ¿Cuál es la medida más precisa de la constante de equilibrio, Ks, para la unión de AP1 a este oligonucleótido dúplex?

Para los dos problemas siguientes, considere un operón eubacteriano hipotético en el que el operador se superpone a la región -10 del promotor. La medición del tiempo de retraso antes de la producción de transcripciones abortivas (en un ensayo de iniciación abortiva) como una función de la inversa de la concentración de ARN polimerasa (1 / [RNAP]) dio los resultados que se muestran a continuación. Los círculos rellenos son los resultados del ensayo en ausencia de represor, y los círculos abiertos son los resultados en presencia de represor unido al operador.

16.7 ¿Cuál es el valor de la constante de tasa directa (kf) para la formación de un complejo cerrado a abierto en las dos condiciones diferentes?

16.8 ¿Cuál es el valor de la constante de equilibrio (KB) para la unión de la ARN polimerasa al promotor en las 2 condiciones?


Contenido

El Premio Nobel de Química de 2006 fue otorgado a Roger D. Kornberg por crear imágenes moleculares detalladas de la ARN polimerasa durante varias etapas del proceso de transcripción. [3]

En la mayoría de los procariotas, una sola especie de ARN polimerasa transcribe todos los tipos de ARN. El "núcleo" de la ARN polimerasa de E. coli consta de cinco subunidades: dos subunidades alfa (α) de 36 kDa, una subunidad beta (β) de 150 kDa, una subunidad beta prima (β ′) de 155 kDa y una pequeña omega (ω) subunidad. Un factor sigma (σ) se une al núcleo y forma la holoenzima. Una vez que comienza la transcripción, el factor se puede desvincular y dejar que la enzima central continúe con su trabajo. [4] [5] El complejo de ARN polimerasa central forma una estructura de "garra de cangrejo" o "mordaza-pinza" con un canal interno que se extiende a lo largo de toda su longitud. [6] Las ARN polimerasas eucariotas y arqueales tienen una estructura central similar y funcionan de manera similar, aunque tienen muchas subunidades adicionales. [7]

Todos los RNAP contienen cofactores metálicos, en particular cationes de zinc y magnesio que ayudan en el proceso de transcripción. [8] [9]

El control del proceso de transcripción de genes afecta los patrones de expresión de genes y, por lo tanto, permite que una célula se adapte a un entorno cambiante, desempeñe funciones especializadas dentro de un organismo y mantenga los procesos metabólicos básicos necesarios para la supervivencia. Por lo tanto, no es de extrañar que la actividad de RNAP sea larga, compleja y altamente regulada. En Escherichia coli bacterias, se han identificado más de 100 factores de transcripción, que modifican la actividad de RNAP. [10]

RNAP puede iniciar la transcripción en secuencias de ADN específicas conocidas como promotores. Luego produce una cadena de ARN, que es complementaria a la cadena de ADN molde. El proceso de agregar nucleótidos a la cadena de ARN se conoce como alargamiento en eucariotas, el RNAP puede construir cadenas de hasta 2.4 millones de nucleótidos (la longitud completa del gen de la distrofina). RNAP liberará preferentemente su transcrito de ARN en secuencias de ADN específicas codificadas al final de los genes, que se conocen como terminadores.

    (ARNm): plantilla para la síntesis de proteínas por los ribosomas. o "genes de ARN": una amplia clase de genes que codifican ARN que no se traduce en proteína. Los ejemplos más destacados de genes de ARN son el ARN de transferencia (ARNt) y el ARN ribosómico (ARNr), ambos involucrados en el proceso de traducción. Sin embargo, desde finales de la década de 1990, se han encontrado muchos genes de ARN nuevos y, por lo tanto, los genes de ARN pueden desempeñar un papel mucho más importante de lo que se pensaba anteriormente.
      (tRNA): transfiere aminoácidos específicos a cadenas polipeptídicas en crecimiento en el sitio ribosómico de síntesis de proteínas durante la traducción (rRNA), un componente de los ribosomas, regula la actividad genética
    • ARN catalítico (ribozima): moléculas de ARN enzimáticamente activas

    RNAP logra de novo síntesis. Puede hacer esto porque las interacciones específicas con el nucleótido iniciador mantienen al RNAP rígidamente en su lugar, lo que facilita el ataque químico al nucleótido entrante. Estas interacciones específicas explican por qué RNAP prefiere comenzar las transcripciones con ATP (seguido de GTP, UTP y luego CTP). A diferencia de la ADN polimerasa, la RNAP incluye actividad helicasa, por lo que no se necesita una enzima separada para desenrollar el ADN.

    Iniciación Editar

    La unión de la ARN polimerasa en bacterias implica que el factor sigma reconozca la región promotora central que contiene los elementos -35 y -10 (ubicados antes de el comienzo de la secuencia a transcribir) y también, en algunos promotores, el dominio C-terminal de la subunidad α reconoce los elementos cadena arriba del promotor. [11] Existen múltiples factores sigma intercambiables, cada uno de los cuales reconoce un conjunto distinto de promotores. Por ejemplo, en E. coli, σ 70 se expresa en condiciones normales y reconoce los promotores de los genes necesarios en condiciones normales ("genes de mantenimiento"), mientras que σ 32 reconoce los promotores de los genes necesarios a altas temperaturas ("genes de choque térmico"). En arqueas y eucariotas, las funciones del factor de transcripción general bacteriano sigma son realizadas por múltiples factores de transcripción generales que trabajan juntos. El complejo cerrado de ARN polimerasa-promotor se denomina habitualmente "complejo de preiniciación de la transcripción". [12] [13]

    Después de unirse al ADN, la ARN polimerasa cambia de un complejo cerrado a un complejo abierto. Este cambio implica la separación de las hebras de ADN para formar una sección desenrollada de ADN de aproximadamente 13 pb, denominada "burbuja de transcripción". El superenrollamiento juega un papel importante en la actividad de la polimerasa debido al desenrollado y rebobinado del ADN. Debido a que las regiones de ADN en frente de RNAP se desenrollan, hay superenrollamientos positivos compensatorios. Las regiones detrás de RNAP se rebobinan y hay superenrollamientos negativos. [13]

    Escape del promotor Editar

    Luego, la ARN polimerasa comienza a sintetizar el heterodúplex ADN-ARN inicial, con ribonucleótidos emparejados en base a la cadena de ADN molde de acuerdo con las interacciones de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Como se señaló anteriormente, la ARN polimerasa hace contactos con la región promotora. Sin embargo, estos contactos estabilizadores inhiben la capacidad de la enzima para acceder al ADN más aguas abajo y, por lo tanto, la síntesis del producto de longitud completa. Para continuar la síntesis de ARN, la ARN polimerasa debe escapar del promotor. Debe mantener los contactos del promotor mientras desenrolla más ADN corriente abajo para la síntesis, "comprimiendo" más ADN corriente abajo en el complejo de iniciación. [14] Durante la transición de escape del promotor, la ARN polimerasa se considera un "intermedio estresado". Termodinámicamente, el estrés se acumula a partir de las actividades de desenrollado y compactación del ADN. Una vez que el heterodúplex de ADN-ARN es lo suficientemente largo (

    10 pb), la ARN polimerasa libera sus contactos aguas arriba y logra efectivamente la transición de escape del promotor a la fase de elongación. El heterodúplex en el centro activo estabiliza el complejo de alargamiento.

    Sin embargo, el escape del promotor no es el único resultado. La ARN polimerasa también puede aliviar el estrés liberando sus contactos posteriores, deteniendo la transcripción. El complejo de transcripción en pausa tiene dos opciones: (1) liberar la transcripción naciente y comenzar de nuevo en el promotor o (2) restablecer un nuevo 3'OH en la transcripción naciente en el sitio activo a través de la actividad catalítica de la ARN polimerasa y volver a comenzar la compresión del ADN para lograr promotor escape. La iniciación abortiva, el ciclo improductivo de la ARN polimerasa antes de la transición de escape del promotor, da como resultado fragmentos cortos de ARN de alrededor de 9 pb en un proceso conocido como transcripción abortiva. El grado de iniciación abortiva depende de la presencia de factores de transcripción y la fuerza de los contactos del promotor. [15]

    Alargamiento Editar

    El complejo transcripcional de 17 pb tiene un híbrido de ADN-ARN de 8 pb, es decir, 8 pares de bases implican el transcrito de ARN unido a la hebra de plantilla de ADN. [ cita necesaria ] A medida que avanza la transcripción, se agregan ribonucleótidos al extremo 3 'de la transcripción de ARN y el complejo de RNAP se mueve a lo largo del ADN. Las tasas de alargamiento características en procariotas y eucariotas son alrededor de 10 a 100 nts / s. [dieciséis]

    Los residuos de aspartilo (asp) en el RNAP retendrán los iones Mg 2+, que, a su vez, coordinarán los fosfatos de los ribonucleótidos. El primer Mg 2+ retendrá el α-fosfato del NTP que se agregará. Esto permite el ataque nucleofílico del 3'OH del transcrito de ARN, agregando otro NTP a la cadena. El segundo Mg 2+ retendrá el pirofosfato del NTP. [17] La ​​ecuación de reacción general es:

    Fidelidad editar

    A diferencia de los mecanismos de corrección de pruebas de la ADN polimerasa, los de RNAP solo se han investigado recientemente. La corrección comienza con la separación del nucleótido mal incorporado de la plantilla de ADN. Esto detiene la transcripción. Luego, la polimerasa retrocede una posición y escinde el dinucleótido que contiene el nucleótido no emparejado. En la ARN polimerasa, esto ocurre en el mismo sitio activo usado para la polimerización y, por lo tanto, es marcadamente diferente de la ADN polimerasa donde la corrección de pruebas ocurre en un sitio activo de nucleasa distinto. [18]

    La tasa de error general es de alrededor de 10 −4 a 10 −6. [19]

    Terminación Editar

    En bacterias, la terminación de la transcripción de ARN puede ser rho-dependiente o rho-independiente. El primero se basa en el factor rho, que desestabiliza el heterodúplex ADN-ARN y provoca la liberación de ARN. [20] Este último, también conocido como terminación intrínseca, se basa en una región palindrómica del ADN. La transcripción de la región provoca la formación de una estructura de "horquilla" a partir de la transcripción del ARN que se enlaza y se enlaza sobre sí misma. Esta estructura de horquilla es a menudo rica en pares de bases G-C, lo que la hace más estable que el propio híbrido ADN-ARN. Como resultado, el híbrido de ADN-ARN de 8 pb en el complejo de transcripción cambia a un híbrido de 4 pb. Estos últimos 4 pares de bases son pares de bases A-U débiles y toda la transcripción de ARN se desprenderá del ADN.

    La terminación de la transcripción en eucariotas se comprende menos que en bacterias, pero implica la escisión de la nueva transcripción seguida de la adición de adeninas independiente de la plantilla en su nuevo extremo 3 ', en un proceso llamado poliadenilación. [21]

    Dado que tanto el ADN como el ARN polimerasas llevan a cabo una polimerización de nucleótidos dependiente del molde, se podría esperar que los dos tipos de enzimas estuvieran estructuralmente relacionados. Sin embargo, los estudios cristalográficos de rayos X de ambos tipos de enzimas revelan que, además de contener un ión Mg 2+ crítico en el sitio catalítico, prácticamente no están relacionados entre sí, de hecho, las enzimas polimerizadoras de nucleótidos dependientes de molde parecen haber surgido de forma independiente dos veces durante la evolución temprana de las células. Un linaje condujo a las modernas ADN polimerasas y transcriptasas inversas, así como a algunas ARN polimerasas de una sola subunidad (ssRNAP) de fagos y orgánulos. [2] El otro linaje de RNAP de múltiples subunidades formó todas las ARN polimerasas celulares modernas. [22] [1]

    Bacterias Editar

    En las bacterias, la misma enzima cataliza la síntesis de ARNm y ARN no codificante (ncRNA).

    RNAP es una molécula grande. La enzima central tiene cinco subunidades (

    • β ': la subunidad β' es la subunidad más grande y está codificada por el gen rpoC. [24] La subunidad β 'contiene parte del centro activo responsable de la síntesis de ARN y contiene algunos de los determinantes de interacciones no específicas de secuencia con el ADN y el ARN naciente. Se divide en dos subunidades en Cyanobacteria y cloroplastos. [25]
    • β: la subunidad β es la segunda subunidad más grande y está codificada por el gen rpoB. La subunidad β contiene el resto del centro activo responsable de la síntesis de ARN y contiene el resto de los determinantes de las interacciones no específicas de secuencia con el ADN y el ARN naciente.
    • α: La subunidad α es la tercera subunidad más grande y está presente en dos copias por molécula de RNAP, α I y α II (una y dos). Cada subunidad α contiene dos dominios: αNTD (dominio N-terminal) y αCTD (dominio C-terminal). αNTD contiene determinantes para el ensamblaje de RNAP. αCTD (dominio C-terminal) contiene determinantes para la interacción con el ADN promotor, lo que genera interacciones no específicas de secuencia en la mayoría de los promotores e interacciones específicas de secuencia en los promotores que contienen elementos aguas arriba, y contiene determinantes para interacciones con factores reguladores.
    • ω: La subunidad ω es la subunidad más pequeña. La subunidad ω facilita el ensamblaje de RNAP y estabiliza el RNAP ensamblado. [26]

    Para unirse a los promotores, el núcleo de RNAP se asocia con el factor de inicio de la transcripción sigma (σ) para formar la holoenzima de la ARN polimerasa. Sigma reduce la afinidad de RNAP por el ADN inespecífico mientras aumenta la especificidad por los promotores, lo que permite que la transcripción se inicie en los sitios correctos. Por tanto, la holoenzima completa tiene 6 subunidades: β'βα I y α II ωσ (

    Eucariotas Editar

    Los eucariotas tienen múltiples tipos de RNAP nucleares, cada uno responsable de la síntesis de un subconjunto distinto de ARN. Todos están relacionados estructural y mecánicamente entre sí y con el RNAP bacteriano:

      sintetiza un pre-ARNr 45S (35S en levadura), que madura en ARNr 28S, 18S y 5.8S, que formarán las principales secciones de ARN del ribosoma. [27] sintetiza precursores de ARNm y la mayoría de snRNA y microARN. [28] Este es el tipo más estudiado y, debido al alto nivel de control requerido sobre la transcripción, se requiere una variedad de factores de transcripción para su unión a los promotores. sintetiza ARNt, ARNr 5S y otros ARN pequeños que se encuentran en el núcleo y el citosol. [29] sintetiza ARNip en plantas. [30] sintetiza ARN implicados en la formación de heterocromatina dirigida por ARNip en plantas. [31]

    Los cloroplastos eucariotas contienen un RNAP muy similar al RNAP bacteriano ("polimerasa codificada por plastidios, PEP"). Utilizan factores sigma codificados en el genoma nuclear. [32]

    El cloroplasto también contiene un segundo RNAP de una sola subunidad, no relacionado estructural y mecánicamente, ("polimerasa codificada por el núcleo, NEP"). Las mitocondrias eucariotas utilizan POLRMT (humano), un RNAP de una sola subunidad codificada por el núcleo. [2] Tales polimerasas de tipo fago se denominan RpoT en plantas. [32]

    Archaea Editar

    Las arqueas tienen un solo tipo de RNAP, responsable de la síntesis de todo el ARN. Archaeal RNAP es estructural y mecánicamente similar al RNAP bacteriano y al RNAP nuclear eucariota I-V, y está especialmente estrechamente relacionado estructural y mecánicamente con el RNAP II eucariota nuclear. [7] [33] La historia del descubrimiento de la ARN polimerasa de arqueas es bastante reciente. El primer análisis del RNAP de un arqueón se realizó en 1971, cuando el RNAP del halófilo extremo Halobacterium cutirubrum fue aislado y purificado. [34] Estructuras cristalinas de RNAP de Sulfolobus solfataricus y Sulfolobus shibatae establezca el número total de subunidades de arqueas identificadas en trece. [7] [35]

    Archaea tiene la subunidad correspondiente a Rpb1 eucariota dividida en dos. No hay homólogo de Rpb9 eucariota (POLR2I) en el S. shibatae complejo, aunque TFS (homólogo de TFIIS) se ha propuesto como uno basado en la similitud. Hay una subunidad adicional denominada Rpo13 junto con Rpo5 que ocupa un espacio lleno por una inserción que se encuentra en las subunidades β 'bacterianas (1.377-1.420 pulg. Taq). [7] Un estudio anterior de menor resolución sobre S. solfataricus La estructura no encontró Rpo13 y solo asignó el espacio a Rpo5 / Rpb5. La Rpo3 se destaca por ser una proteína de hierro y azufre. La subunidad AC40 de RNAP I / III que se encuentra en algunos eucariotas comparte secuencias similares, [35] pero no se une al hierro. [36] Este dominio, en cualquier caso, cumple una función estructural. [37]

    La subunidad Archaeal RNAP usó previamente una nomenclatura "RpoX" donde a cada subunidad se le asigna una letra de una manera que no está relacionada con ningún otro sistema. [1] En 2009, se propuso una nueva nomenclatura basada en la numeración de la subunidad eucariota Pol II "Rpb". [7]

    Virus Editar

    Los ortopoxvirus y algunos otros virus nucleocitoplasmáticos de ADN grande sintetizan ARN utilizando un RNAP de múltiples subunidades codificado por virus. Son más similares a los RNAP eucariotas, con algunas subunidades minimizadas o eliminadas. [38] Exactamente a qué RNAP son más similares es un tema de debate. [39] La mayoría de los otros virus que sintetizan ARN utilizan mecanismos no relacionados.

    Muchos virus utilizan un RNAP dependiente de ADN de una sola subunidad (ssRNAP) que está relacionado estructural y mecánicamente con el RNAP de una sola subunidad de los cloroplastos eucariotas (RpoT) y mitocondrias (POLRMT) y, más distante, con las ADN polimerasas y las transcriptasas inversas. Quizás el RNAP de subunidad única más estudiado es la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Los ssRNAP no pueden revisar. [2]

    B. subtilis profage SPβ usos YonO, un homólogo de las subunidades β + β 'de msRNAP para formar un RNAP monomérico (ambos cilindros en la misma cadena) distinto del ssRNAP de "mano derecha" habitual. Probablemente se separó hace mucho tiempo del msRNAP canónico de cinco unidades, antes de la época del último ancestro común universal. [40] [41]

    Otros virus utilizan un RNAP dependiente de ARN (un RNAP que emplea ARN como plantilla en lugar de ADN). Esto ocurre en virus de ARN de cadena negativa y virus de ARNdc, los cuales existen durante una parte de su ciclo de vida como ARN de doble cadena. Sin embargo, algunos virus de ARN de cadena positiva, como el poliovirus, también contienen ARNAP dependiente de ARN. [42]

    El RNAP fue descubierto de forma independiente por Charles Loe, Audrey Stevens y Jerard Hurwitz en 1960. [43] Para entonces, la mitad del Premio Nobel de Medicina de 1959 había sido otorgado a Severo Ochoa por el descubrimiento de lo que se creía que era RNAP. [44] pero en cambio resultó ser polinucleótido fosforilasa.


    El esquema evolutivo del ARN Pol de eubacterias a eucariotas

    Todos los pols de ARN, desde eubacterias hasta eucariotas superiores, comparten un funcionamiento mecanicista básico: uso de una plantilla de ADN, translocación procesiva en la plantilla durante la síntesis de ARN, utilización de trifosfato de ribonucleósido como sustratos, emparejamiento de bases de Watson & # x02013Crick del nuevo nucleótido agregado con el complementario uno en el ADN molde y la formación de un nuevo fosfodiéster unido por un mecanismo dependiente de metales. Para realizar estas funciones básicas, todos los polos de ARN contienen dos subunidades más grandes (Figura 1) con motivos de doble barril & # x003c8 & # x003b2 que crean un sitio activo en la interfaz de las subunidades con tres residuos aspárticos clave conservados en todos los dominios de la vida . Además, los pols de ARN de múltiples subunidades contienen un número variable de subunidades más pequeñas adicionales (Figura 1). Se cree que las dos subunidades catalíticas más grandes de ARN pols evolucionaron a partir de la duplicación y diversificación de un gen que codificaba un cofactor proteico de una ribozima ancestral común, que realizaba actividad de ARN polimerasa en el mundo del ARN primario (Iyer et al., 2003) . En algún momento de la evolución, la nueva proteína heterodímera habría ganado actividad polimerasa y adquirido diferentes subunidades con funciones auxiliares y de ensamblaje especializadas. Por lo tanto, todos los pols de ARN de múltiples subunidades comparten un núcleo estructural común y mecanismos moleculares básicos similares y deben derivar del ARN pol del último ancestro común universal (LUCA) de arqueas, eubacterias y eucariotas, que se supone que existieron 3.5 & # x020133.8 hace mil millones de años (Burton, 2014). Este pol de ARN de múltiples subunidades ancestrales era probablemente similar al pol de ARN simple que se encuentra hoy en las eubacterias, que está formado (ver Figura 1) por dos grandes subunidades catalíticas & # x003b2 y & # x003b2 & # x02019, dos subunidades de ensamblaje (2 & # x003b1), y una subunidad auxiliar (& # x003c9), ya que todas estas cinco subunidades están muy conservadas en la estructura / función de todos los organismos (Werner, 2007 Werner y Grohmann, 2011).

    Historia evolutiva y organización de subunidades de polimerasas de ARN eucariotas nucleares. (A) Se supone que el último ancestro común universal (LUCA) de todos los organismos tiene una ARN polimerasa multisubunidad dependiente de ADN. Hoy en día, todos los seres vivos tienen pols de ARN con un núcleo de cinco a siete subunidades. Después Eubacterias separación, el antepasado común de Arqueas y Eukarya se agregaron subunidades periféricas adicionales. Finalmente, después de la emergencia de eucariotas, el Arqueas-núcleo derivado comenzó a desarrollar ARN polimerasas especializadas. Los ARN pols I y III especializados integraron algunos factores de transcripción como subunidades permanentes que, en el ARN pol II, permanecen independientes (TFIIS, TFIIF, TFIIE). Los ARN pol IV y V no se describen completamente. Sólo se indica la ramificación después de la separación del ARN pol I. Consulte el texto principal para obtener más descripciones. (B) La tabla muestra un esquema comparativo de las subunidades pol de ARN alineadas según la secuencia y / o la homología funcional. Los colores corresponden al esquema estructural de la pieza. (A). Tenga en cuenta que las subunidades Rpb5 y 6 son parte tanto del núcleo como de los conjuntos de cinco unidades de subunidades comunes a los tres pols de ARN eucariotas. Archaeal Rpo13 no tiene equivalente en eucariotas, y el TFS de Arqueas es un factor homólogo independiente del TFIIS eucariota. Ver Werner y Grohmann (2011) Vannini y Cramer (2012) y Huang et al. (2015) para obtener más detalles sobre la estructura y evolución de la subunidad pol de ARN.

    El ARN pol ganó mayor complejidad en términos de adquisición de nuevas subunidades luego de la división de las ramas eubacteriana y arqueal & # x02013eukaryotic del árbol universal de la vida (Werner, 2007 Spang et al., 2015). Archaeal RNA pol tiene tres o cuatro polipéptidos catalíticos y tres subunidades de ensamblaje y auxiliares, que están estrechamente relacionadas con las bacterianas (Figura 1). Sin embargo, archaeal RNA pol ha ganado cinco subunidades periféricas adicionales sin homólogos en las eubacterias pero que se asemejan a subunidades eucariotas, que estabilizan las interacciones de la polimerasa con el ADN molde, el ARN recién sintetizado y diferentes factores de transcripción para asegurar un funcionamiento eficiente en el ciclo de transcripción (Werner, 2007 Werner y Grohmann, 2011 Fouqueau et al., 2017). Las maquinarias de transcripción más complejas de arqueas y eucariotas están relacionadas con el hecho de que sus genomas, que difieren del genoma eubacteriano, están estabilizados y compactados por histonas o proteínas similares a las histonas que imponen un acceso más restrictivo al ADN y la necesidad de una transcripción basal adicional. (Reeve, 2003 Geiduschek y Ouhammouch, 2005 Kwapisz et al., 2008 Jun et al., 2011 Werner y Grohmann, 2011 Koster et al., 2015).

    Los linajes arqueales y eucariotas divergieron hace más de 2 mil millones de años, y los eucariotas se originaron en un linaje arqueal con proteínas distintivas eucariotas ya diversas (Spang et al., 2015). Otras diferencias importantes incluyen que los eucariotas tienen un sistema extendido de membranas intracelulares que compartimenta el espacio intracelular, y el volumen celular es de tres a cuatro órdenes de magnitud mayor que el de las arqueas y las bacterias (Lane y Martin, 2010 Koonin, 2015). También contienen orgánulos (mitocondrias y cloroplastos) que se derivan de dos tipos de eubacterias y tienen su propio ARN pol (De Duve, 2007). La diferencia más destacada para la transcripción nuclear que surge con eucariotas es la diversificación en tres pols de ARN nucleares diferentes con funciones especializadas: el ARN pol I es responsable de la síntesis de una sola transcripción, a saber, el ARN ribosómico precursor, que se procesa en 28S, 5.8S y 18S rRNAs RNA pol II sintetiza una amplia diversidad de transcripciones, incluido el RNA mensajero codificador de proteínas (mRNA) y muchos ncRNA, como microRNAs (mi), small nuclear (sn) y small nucleolar (sno) RNAs RNA pol III sintetiza diversos ARN de transferencia (ARNt) y ARNr 5S, y también ARN nuclear pequeño U6 y otros ARN pequeños no codificantes (Dieci et al., 2007). Hay dos pols de ARN nucleares adicionales en las plantas (IV y V), involucrados en la transcripción de ncRNA que son necesarios para el silenciamiento de genes transcripcionales a través de la metilación del ADN dirigida por ARN (Zhou y Law, 2015). En esta revisión, nos centraremos en la estructura y función de los ARN pols I, II y III.

    Los pols de ARN eucariotas mejor estudiados son los de la levadura en ciernes. Saccharomyces cerevisiae, y se cree que son buenos modelos para otros pols de ARN eucariotas. Por esta razón, usamos los nombres de genes y subunidades de pols de ARN de levadura a lo largo de esta revisión (Figura 1). Los pols I, II y III de ARN de levadura tienen un núcleo estructuralmente conservado en forma de herradura formado por 10 subunidades (Figura 1) homólogas a las subunidades pol de ARN de arqueas y un número diferente de subunidades específicas de eucariotas periféricas adicionales (Darst, 2001 Werner, 2007 Cramer et al., 2008). Los 10 núcleos de subunidades incluyen las dos subunidades catalíticas más grandes (las dos filas superiores en la Figura 1B), cinco subunidades adicionales (Rpb5, 6, 8, 10 y 12) comunes a los tres pol de ARN nucleares, la subunidad A12 / Rpb9 / C11 involucrado en la corrección de pruebas (ver más abajo) y el heterodímero AC40 & # x02013AC19, compartido entre RNA pols I y III y homólogo a Rpb3 & # x02013Rpb11 en RNA pol II (Fern & # x000e1ndez-Tornero et al., 2013). Las subunidades pol de ARN de levadura de la periferia adicionales son principalmente esenciales para la viabilidad celular, pero no son estrictamente necesarias para la polimerización de ARN. En cambio, aumentan el potencial regulador y permiten la especialización de cada pol de ARN en la transcripción de un subconjunto no redundante de genes (Werner, 2007 Cramer et al., 2008 Koster et al., 2015). El ARN pol II tiene un dímero disociable (Rpb4 / 7) que juega un papel importante durante la elongación multifacética de la transcripción de este ARN pol. Este dímero tiene una homología con el dímero Rpo4 / 7 del ARN pol de arquea y tiene una contraparte (con baja homología) en los dímeros A14 / A43 y C17 / C25 de los ARN pols I y III, respectivamente (Figura 1). El ARN pol I tiene un dímero adicional (A49 / A34) que tiene un equivalente en el ARN pol III (C37 / C53) pero no es una parte constitutiva del ARN pol II donde su función es realizada por el factor TFIIF independiente (& # x003b1 / & # x003b2 dimer Vannini y Cramer, 2012). Este dímero juega un papel específico en el modo particular de iniciación de los tres ARN pols (Abascal-Palacios et al., 2018) y en la terminación del ARN pol III (Hoffmann et al., 2015 Arimbasseri y Maraia, 2016) que difiere mucho de los otros dos pols de ARN en esta etapa (Proshkina et al., 2006 Werner y Grohmann, 2011). El ARN pol III tiene un trímero adicional y totalmente específico (C31 / C34 / C82) que es homólogo al ARN pol II TFIIE y se propone que esté involucrado en el mecanismo de iniciación del ARN pol III (Hoffmann et al., 2015). Se ha propuesto que este trímero sea híbrido de TFIIF & # x02013TFIIE en lugar de simplemente un subcomplejo similar a TFIIE (Abascal-Palacios et al., 2018).

    La coexistencia de las subunidades centrales más grandes conservadas, pero diferentes, de las tres pols de ARN (A190 / A135, Rpb1 / Rpb2 y C160 / C128 en las pols de ARN I, II y III, respectivamente) en todos los eucariotas es notable y sugiere su divergencia evolutiva temprana. Al mismo tiempo, la conservación sustancial del núcleo pol de ARN central desde LUCA indica que realiza procesos esenciales requeridos para la expresión génica que permite muy poca innovación. Por lo tanto, para generar eucariotas complejos, se espera que la mayor parte de la innovación evolutiva ocurra en las subunidades de la periferia, especialmente en el ARN pol II, que especifica el proteoma celular que confiere características únicas a diferentes tipos de células a través de la síntesis de ARNm. Además, el único CEl dominio terminal (CTD) de la subunidad catalítica más grande (Rpb1) del ARN pol II también es una fuente de innovación en la regulación de la transcripción del ARNm y una marca del linaje eucariota (Burton, 2014). CTD consiste en una estructura repetitiva rica en serina y otros aminoácidos fosforilables, que aumenta en número de repeticiones con mayor complejidad evolutiva. Otra consecuencia de la innovación eucariota es la estructura compleja del ARN pol III con 17 subunidades, todas las cuales se conservan hasta cierto punto en eucariotas desde levaduras hasta humanos. Esto apoya la noción de la divergencia temprana del ARN pol III del ARN pols I y II (Proshkina et al., 2006 Figura 1). De todas estas consideraciones, se puede sugerir que el último ancestro común eucariota probablemente ya tenía ARN pols I, II y III distintas, así como la estructura repetitiva en el CTD del ARN pol II (Proshkina et al., 2006 Yang y Stiller, 2014). Se puede concluir que la existencia y evolución de los tres pols de ARN especializados en células eucariotas habrían permitido la división del trabajo y permitido una regulación genética intrincada en organismos complejos multicelulares que requieren la regulación del ciclo celular, tejido específico, ambiental y del desarrollo de expresión génica (Dieci et al., 2007 Cramer, 2019). Se cree que los ARN pols IV y V han evolucionado más recientemente a partir del ARN pol II a través de la subfuncionalización de las actividades de silenciamiento realizadas por el ARN pol II en hongos y metazoos en las primeras plantas terrestres (Huang et al., 2015).


    El material genético se almacena en forma de ADN en la mayoría de los organismos. En los seres humanos, el núcleo de cada célula contiene 3 × 10 9 pares de bases de ADN distribuidos en 23 pares de cromosomas, y cada célula tiene dos copias del material genético. Esto se conoce colectivamente como el genoma humano. El genoma humano contiene alrededor de 30 000 genes, cada uno de los cuales codifica una proteína.

    Se transcriben grandes extensiones de ADN en el genoma humano, pero no codifican proteínas. Estas regiones se llaman intrones y constituyen alrededor del 95% del genoma. La secuencia de nucleótidos del genoma humano se conoce ahora con un grado razonable de precisión, pero aún no entendemos por qué gran parte de ella no es codificante. Parte de este ADN no codificante controla la expresión génica, pero aún no se comprende el propósito de gran parte de él. Este es un tema fascinante que seguramente avanzará rápidamente en los próximos años.

    los Dogma central de la biología molecular Establece que El ADN produce ARN produce proteínas (Figura 1).

    Figura 1 | El dogma central de la biología molecular: el ADN produce ARN produce proteínas

    El proceso por el cual el ADN se copia en ARN se llama transcripción, y el proceso por el cual el ARN se usa para producir proteínas se llama traducción.

    Replicación de ADN

    Cada vez que una célula se divide, cada una de sus cadenas dobles de ADN se divide en dos cadenas simples. Cada una de estas hebras simples actúa como plantilla para una nueva hebra de ADN complementario. Como resultado, cada nueva célula tiene su propio genoma completo. Este proceso se conoce como Replicación de ADN. La replicación está controlada por el emparejamiento de Watson-Crick de las bases en la hebra molde con los desoxinucleósidos trifosfatos entrantes y está dirigida por las enzimas ADN polimerasa. Es un proceso complejo, particularmente en eucariotas, que involucra una variedad de enzimas. En la Figura 2 se describe una versión simplificada de la replicación del ADN bacteriano.

    Figura 2 | Replicación del ADN en bacterias Representación simplificada de la replicación del ADN en bacterias.

    La biosíntesis del ADN procede en la dirección 5 & principal a 3 & principal. Esto hace imposible que las ADN polimerasas sinteticen ambas cadenas simultáneamente. Una parte de la doble hélice debe primero desenrollarse, y esto está mediado por helicasa enzimas.

    La hebra principal se sintetiza continuamente, pero la hebra opuesta se copia en ráfagas cortas de aproximadamente 1000 bases, a medida que la plantilla de hebra retrasada está disponible. Las hebras cortas resultantes se llaman Fragmentos de Okazaki (después de sus descubridores, Reiji y Tsuneko Okazaki). Las bacterias tienen al menos tres ADN polimerasas distintas: Pol I, Pol II y Pol III, es Pol III la que participa en gran medida en el alargamiento de la cadena. Curiosamente, las ADN polimerasas no pueden iniciar la síntesis de ADN de novo, pero requiere una imprimación corta con un grupo 3 & prime-hidroxilo libre. Esta es producida en la hebra rezagada por una ARN polimerasa (llamada ADN primasa) que es capaz de utilizar la plantilla de ADN y sintetizar un fragmento corto de ARN de alrededor de 20 bases de longitud. Pol III puede entonces asumir el control, pero eventualmente se encuentra con uno de los fragmentos cortos de ARN previamente sintetizados en su camino. En este punto, Pol I asume el control, utilizando su actividad de exonucleasa 5 & prime- to 3 & prime-exonucleasa para digerir el ARN y llenar el espacio con ADN hasta que alcanza un tramo continuo de ADN. Esto deja una brecha entre el extremo primario 3 & del ADN recién sintetizado y el extremo primario 5 & del ADN sintetizado previamente por Pol III. El espacio se llena con ADN ligasa, una enzima que forma un enlace covalente entre un grupo 5 & prime-fosfato y un grupo 3 & prime-hidroxilo (Figura 3). El inicio de la replicación del ADN en la cadena principal es más complejo y se analiza en detalle en textos más especializados.

    Figura 3 | ADN polimerasas en la replicación del ADN Representación simplificada de la acción de las ADN polimerasas en la replicación del ADN en bacterias.

    Errores en la replicación del ADN

    La replicación del ADN no es perfecta. Se producen errores en la replicación del ADN, cuando la base incorrecta se incorpora a la cadena de ADN en crecimiento. Esto lleva a desajustado pares de bases, o desajustes. Las ADN polimerasas tienen actividad de corrección de pruebas, y se han desarrollado enzimas reparadoras del ADN para corregir estos errores. Ocasionalmente, los pares erróneos sobreviven y se incorporan al genoma en la siguiente ronda de replicación. Estas mutaciones pueden no tener consecuencias, pueden resultar en la muerte del organismo, pueden resultar en una enfermedad genética o cáncer o pueden dar al organismo una ventaja competitiva sobre sus vecinos, lo que conduce a la evolución por selección natural.

    Transcripción

    La transcripción es el proceso mediante el cual se copia el ADN (transcrito) al ARNm, que transporta la información necesaria para la síntesis de proteínas. La transcripción se realiza en dos amplios pasos. Primero, se forma el ARN pre-mensajero, con la participación de las enzimas ARN polimerasa. El proceso se basa en el emparejamiento de bases de Watson-Crick, y la hebra única de ARN resultante es el complemento inverso de la secuencia de ADN original. El ARN pre-mensajero se "edita" para producir la molécula de ARNm deseada en un proceso llamado Empalme de ARN.

    Formación de ARN pre-mensajero

    El mecanismo de transcripción tiene paralelos con el de la replicación del ADN. Al igual que con la replicación del ADN, el desenrollamiento parcial de la doble hélice debe ocurrir antes de que pueda tener lugar la transcripción, y son las enzimas ARN polimerasa las que catalizan este proceso.

    A diferencia de la replicación del ADN, en la que se copian ambas hebras, solo se transcribe una hebra. La hebra que contiene el gen se llama sentido hebra, mientras que la hebra complementaria es la antisentido hebra. El ARNm producido en la transcripción es una copia de la hebra sentido, pero es la hebra antisentido la que se transcribe.

    Los trifosfatos de ribonucleósidos (NTP) se alinean a lo largo de la hebra de ADN antisentido, con emparejamiento de bases Watson-Crick (pares A con U). La ARN polimerasa une los ribonucleótidos para formar una molécula de ARN pre-mensajero que es complementaria a una región de la hebra de ADN antisentido. La transcripción finaliza cuando la enzima ARN polimerasa alcanza un triplete de bases que se lee como una señal de "parada". La molécula de ADN se vuelve a enrollar para volver a formar la doble hélice.

    Figura 4 | Transcripción Representación simplificada de la formación de ARN pre-mensajero (naranja) a partir de ADN bicatenario (azul) en la transcripción.

    Empalme de ARN

    El ARN premensajero así formado contiene intrones que no son necesarios para la síntesis de proteínas. El ARN pre-mensajero se corta para eliminar los intrones y crear ARN mensajero (ARNm) en un proceso llamado empalme de ARN (Figura 5).

    Figura 5 | Empalme de ARN Los intrones se cortan del ARN pre-mensajero para dar ARN mensajero (ARNm).

    Splicing alternativo

    En el empalme alternativo, los exones individuales se empalman o se incluyen, dando lugar a varios productos de ARNm posibles diferentes. Cada producto de ARNm codifica una isoforma de proteína diferente, estas isoformas de proteína difieren en su secuencia de péptidos y, por lo tanto, en su actividad biológica. Se estima que hasta el 60% de los productos génicos humanos se someten a un empalme alternativo. Se conocen varios mecanismos diferentes de empalme alternativo, dos de los cuales se ilustran en la Figura 6.

    Figura 6 | Empalme alternativo Existen varios mecanismos diferentes de empalme alternativo: un exón de casete puede incluirse o excluirse del ARN final (arriba), o dos exones de casete pueden ser mutuamente excluyentes (abajo).

    El empalme alternativo contribuye a la diversidad de proteínas: una transcripción de un solo gen (ARN) puede tener miles de patrones de empalme diferentes y, por lo tanto, codificará miles de proteínas diferentes: se genera un proteoma diverso a partir de un genoma relativamente limitado. El empalme es importante en la regulación genética (la alteración del patrón de empalme en respuesta a las condiciones celulares cambia la expresión de las proteínas). Quizás no sea sorprendente que los patrones de empalme anormales pueden conducir a estados de enfermedad, incluido el cáncer.

    Transcripción inversa

    En la transcripción inversa, el ARN se "transcribe de forma inversa" en ADN. Este proceso, catalizado por enzimas de transcriptasa inversa, permite que los retrovirus, incluido el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), utilicen ARN como material genético. Las enzimas transcriptasa inversa también han encontrado aplicaciones en biotecnología, lo que permite a los científicos convertir ARN en ADN para técnicas como la PCR.

    Traducción

    El ARNm formado en la transcripción se transporta fuera del núcleo, al citoplasma, al ribosoma (la fábrica de síntesis de proteínas de la célula). Aquí, dirige la síntesis de proteínas. El ARN mensajero no participa directamente en la síntesis de proteínas; para ello, se requiere ARN de transferencia (ARNt). El proceso por el cual el ARNm dirige la síntesis de proteínas con la ayuda del ARNt se llama traducción.

    El ribosoma es un complejo muy grande de moléculas de ARN y proteínas. Cada tramo de tres bases de ARNm (triplete) se conoce como un codóny un codón contiene la información de un aminoácido específico. A medida que el ARNm pasa a través del ribosoma, cada codón interactúa con el anticodón de una molécula de ARN de transferencia específica (ARNt) mediante emparejamiento de bases Watson-Crick. Esta molécula de ARNt lleva un aminoácido en su extremo 3 & principal, que se incorpora a la cadena de proteínas en crecimiento. A continuación, el ARNt se expulsa del ribosoma. La Figura 7 muestra los pasos involucrados en la síntesis de proteínas.

    Figura 7 | La traducción (a) y (b) las moléculas de ARNt se unen a los dos sitios de unión del ribosoma, y ​​mediante la unión de hidrógeno al ARNm (c) se forma un enlace peptídico entre los dos aminoácidos para formar un dipéptido, mientras que la molécula de ARNt se deja sin carga (d) la molécula de ARNt sin carga abandona el ribosoma, mientras que el ribosoma se mueve un codón hacia la derecha (el dipéptido se transloca de un sitio de unión al otro) (e) otra molécula de ARNt se une (f) se forma un enlace peptídico entre los dos aminoácidos para formar un tripéptido (g) la molécula de ARNt sin carga abandona el ribosoma.

    Transferencia de ARN

    El ARN de transferencia adopta una estructura terciaria bien definida que normalmente se representa en dos dimensiones como una forma de hoja de trébol, como en la Figura 7. La estructura del ARNt se muestra con más detalle en la Figura 8.

    Figura 8 | Estructuras bidimensionales del ARNt (ARN de transferencia) En algunos ARNt, el brazo de DHU tiene solo tres pares de bases.

    Cada aminoácido tiene su propio ARNt especial (o conjunto de ARNt). Por ejemplo, el tRNA de la fenilalanina (tRNAPhe) es diferente al de la histidina (tRNAHis). Cada aminoácido se une a su ARNt a través del grupo 3 & prime-OH para formar un éster que reacciona con el grupo α-amino del aminoácido terminal de la cadena de proteínas en crecimiento para formar un nuevo enlace amida (enlace peptídico) durante la síntesis de proteínas. (Figura 9). La reacción de ésteres con aminas es generalmente favorable, pero la velocidad de reacción aumenta mucho en el ribosoma.

    Figura 9 | Síntesis de proteínas Reacción de la cadena polipeptídica en crecimiento con el extremo 3 & del tRNA cargado. El aminoácido se transfiere de la molécula de ARNt a la proteína.

    Cada molécula de ARN de transferencia tiene una estructura terciaria bien definida que es reconocida por la enzima aminoacil ARNt sintetasa, que agrega el aminoácido correcto al extremo 3 & principal del ARNt no cargado. La presencia de nucleósidos modificados es importante para estabilizar la estructura del ARNt. Algunas de estas modificaciones se muestran en la Figura 10.

    Figura 10 | Bases modificadas en el ARNt Estructuras de algunas de las bases modificadas que se encuentran en el ARNt.

    El código genético

    El código genético es casi universal. Es la base de la transmisión de información hereditaria por ácidos nucleicos en todos los organismos. Hay cuatro bases en el ARN (A, G, C y U), por lo que hay 64 códigos de triplete posibles (4 3 = 64). En teoría, solo se requieren 22 códigos: uno para cada uno de los 20 aminoácidos naturales, con la adición de un codón de inicio y un codón de terminación (para indicar el comienzo y el final de una secuencia de proteínas). Muchos aminoácidos tienen varios códigos (degeneración), de modo que se utilicen los 64 códigos de triplete posibles. Por ejemplo, Arg y Ser tienen cada uno 6 codones, mientras que Trp y Met tienen solo uno. No hay dos aminoácidos que tengan el mismo código, pero los aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen propiedades físicas o químicas similares tienden a tener secuencias de codones similares, p. las cadenas laterales de Phe, Leu, Ile, Val son todas hidrófobas, y Asp y Glu son ambos ácidos carboxílicos (ver Figura 11). Esto significa que si se selecciona el ARNt incorrecto durante la traducción (debido al apareamiento incorrecto de una sola base en la interfaz codón-anticodón), el aminoácido incorporado incorrectamente probablemente tendrá propiedades similares a la molécula de ARNt deseada. Aunque la proteína resultante tendrá un aminoácido incorrecto, tiene una alta probabilidad de ser funcional. Los organismos muestran "sesgo de codones" y usan ciertos codones para un aminoácido en particular más que otros. Por ejemplo, el uso de codones en humanos es diferente al de bacterias, a veces puede ser difícil expresar una proteína humana en bacterias porque el tRNA relevante puede estar presente en una concentración demasiado baja.

    Figura 11 | El código genético - asignaciones de codones triplete para los 20 aminoácidos. Además de codificar la metionina, AUG se utiliza como codón de inicio, iniciando la biosíntesis de proteínas.

    Un ejercicio de uso del código genético

    Una hebra de ADN genómico (hebra A, hebra codificante) contiene la siguiente secuencia de lectura de 5 & prime- a 3 & prime-:

    Esta hebra formará el siguiente dúplex:

    La secuencia de bases en la otra hebra de ADN (hebra B) escrita 5 & prime- to 3 & prime- es por lo tanto

    La secuencia de bases en el ARNm transcrito de la cadena A del ADN escrito 5 & prime- a 3 & prime- es

    La secuencia de aminoácidos codificada por el ARNm anterior es

    Sin embargo, si la cadena de ADN B es la cadena codificante, la secuencia de ARNm será:

    y la secuencia de aminoácidos será:

    La hipótesis del bamboleo

    Una inspección minuciosa de todos los codones disponibles para un aminoácido particular revela que la variación es mayor en la tercera posición (por ejemplo, los codones para la alanina son GCU, GCC, GCA y GCG). Crick y Brenner propusieron que una sola molécula de ARNt puede reconocer codones con diferentes bases en el extremo primario 3 & debido a la formación de pares de bases que no son de Watson-Crick con la tercera base en la interacción codón-anticodón. Estos pares de bases no estándar son diferentes en forma de A · U y G · C y el término hipótesis del bamboleo indica que se permite un cierto grado de flexibilidad o "bamboleo" en esta posición del ribosoma. No todas las combinaciones son ejemplos posibles de emparejamientos "permitidos" que se muestran en la Figura 12.

    Figura 12 | Estructuras de pares de bases oscilantes que se encuentran en el ARN

    La capacidad de las bases de ADN para formar pares de bases oscilantes, así como los pares de bases de Watson-Crick, puede dar como resultado que se produzcan desajustes de pares de bases durante la replicación del ADN. Si no se reparan con enzimas reparadoras del ADN, estos desajustes pueden provocar enfermedades genéticas y cáncer.


    3 respuestas 3

    No existe una diferencia fundamental entre el ARN viral y el ARN celular nativo que no sea la secuencia de bases de ARN en ellos. Las diferencias de secuencia no son bioquímicamente evidentes en el ARN, solo en los productos proteicos producidos a partir de los ARN.

    La regulación del ARN nativo se realiza de una gran variedad de formas (nada en la célula se diseñado todo es ad hoc, por lo que se puede establecer cualquier casualidad). La regulación nativa es esencial, de lo contrario se producirá una producción descontrolada que conducirá a la muerte celular o al cáncer.

    Gran parte, si no la mayor parte, de la regulación nativa se realiza regulando la transcripción del ADN en ARN. Una vez que el ARN está en el citosol, se realiza poca regulación adicional, por lo que el ARN viral en el citosol tiene el control de la fábrica de proteínas celulares. Pero al menos algunos virus han adquirido ventajas adicionales que ayudan a que su ARN compita con los ARNm nativos para el uso de la maquinaria proteica (ver, por ejemplo, Secuestro del aparato de traducción por virus ARN)

    Por lo tanto, no es realmente fácil "etiquetar una secuencia de ARN como peligrosa simplemente porque no está regulada", ya que la amplia gama de ARN normales en el citosol no proporciona una base para determinar si alguna está "no regulada" y la célula no puede estar protegido de esa manera.

    El autoensamblaje está muy extendido en las funciones celulares normales, así como en la producción viral. Las moléculas involucradas tienen puntos de atracción afilados durante mucho tiempo para sus moléculas de pareja, y en la sopa molecular agitada de la célula, las moléculas pronto pueden chocar entre sí y unirse. Gracias a la producción descontrolada del virus, las nuevas partículas virales tienen muchas moléculas componentes disponibles para este ensamblaje.

    (Si te preguntas que estoy publicando dos respuestas, es porque esta publicación q hizo dos preguntas en una).

    Respecto al tema del autoensamblaje de virus. de hecho, estudiarlo ha sido un tema desafiante. Hay un documento PNAS reciente (2019) sobre eso:

    A pesar de décadas de estudio, la forma en que las cápsides se autoensamblan sigue siendo un misterio, porque no existían métodos para medir la cinética de ensamblaje de las cápsides individuales. Superamos este obstáculo utilizando una técnica de microscopía sensible basada en interferometría láser. Las mediciones muestran que se debe formar un pequeño núcleo de proteínas en el ARN viral antes de que se ensamble la cápside.

    Resumen de la medida. (A) Un modelo estructural de la cápside MS2 (ID de PDB: 2ms2) muestra su pequeño tamaño y estructura T = 3. Las 2 configuraciones de dímeros de proteína de cubierta se muestran en gris y violeta. (B) Inyectamos una solución de dímeros sin ensamblar sobre un cubreobjetos en el que las cadenas de ARN de MS2 están unidas por enlaces de ADN. A medida que los dímeros se unen al ARN, las partículas resultantes dispersan la luz. Las partículas aparecen como puntos oscuros de difracción limitada debido a la interferencia destructiva entre la luz dispersa y un haz de referencia. (C) Monitoreamos muchos de estos puntos en paralelo. Se muestra una imagen típica del campo de visión, tomada 126 s después de agregar dímeros de 2 μM y que representa un promedio de 1,000 cuadros tomados a 1,000 cuadros por segundo. (D) La intensidad de cada punto es proporcional al número de proteínas unidas dentro de cada partícula y los cambios en la intensidad en función del tiempo revelan la cinética de ensamblaje de cada partícula. Cuanto más oscura es la mancha, mayor es su intensidad. (D, arriba) Serie temporal de imágenes para el punto encuadrado en C. (D, abajo) Traza de intensidad para el mismo punto usando un promedio de 1000 cuadros. Discutimos la relación entre la intensidad y el número de proteínas unidas, así como cómo calculamos la intensidad del punto, en Materiales y métodos y en el Apéndice SI.

    Y un poco más sobre la dinámica observada:

    Encontramos que el "tiempo de crecimiento", el tiempo requerido para que una partícula alcance el tamaño de una cápside completa después de nuclearse, varía de partícula a partícula, desde 30 hasta más de 200 s (Fig. 2A y Apéndice SI, Fig. S1). De las partículas que crecen hasta formar una cápside completa, algunas crecen a un ritmo constante, otras se ralentizan a medida que se acercan a su finalización y otras contienen pausas intermedias que duran hasta 25 s (Fig. 2A y Apéndice SI, Fig. S1). A pesar de estas diferencias, esencialmente todas las trazas son monótonas, con pocos o ningún paso de desmontaje observable.

    Así que sí, curiosamente, la cápside del virus simplemente se construye y se construye a sí misma incluso si se toma un & quot; descanso para el almuerzo & quot; no es un problema revertir el progreso de la construcción de una manera significativa.

    Los modos de falla de este proceso de autoensamblaje están realmente relacionados con la construcción / atracción de "demasiadas cosas", o dos (o más) ARN virales que se enredan con fragmentos de proteínas comunes que ambos (todos) atraen. Básicamente, demasiada densidad de materiales de construcción puede generar problemas.

    Los tiempos de crecimiento también disminuyen al aumentar la concentración de proteína, pero menos rápidamente que los tiempos de nucleación (Fig. 4A) [abajo]. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que el ARN, que promueve la nucleación a baja concentración de proteínas, crea una competencia entre la nucleación y el crecimiento que puede conducir a estructuras sobrecrecidas a mayor concentración, como se muestra en la Fig. 4B. Esta vía proporciona una posible explicación para las estructuras de "monstruo" (5) y "multiplete" (19) observadas con otros virus de ARN.

    En general, estoy de acuerdo con mgkrebbs (+1), pero tenga en cuenta que, si bien los virus generalmente tienen algún tipo de subunidad de replicasa de ARN (RdRP) para ayudarlos, los viroides carecen por completo de ellos, pero logran reproducirse:

    Mientras que los virus de ARN codifican subunidades del complejo enzimático (replicasa de ARN) que cataliza la iniciación y elongación de las cadenas de ARN viral, los viroides deben depender para este paso de replicación de las ARN polimerasas preexistentes del hospedador. En principio, los mejores candidatos serían las ARN polimerasas dependientes de ARN, cuya existencia en plantas se conoce desde hace mucho tiempo. Sin embargo, los viroides no utilizan estas enzimas para su replicación, sino que las ARN polimerasas dependientes de ADN se redirigen para aceptar moldes de ARN.

    Lo más parecido a un viroide en humanos es la hepatitis D. Hasta el año pasado, se pensaba que era principalmente una enfermedad humana, pero una encuesta de 2019 encontró que los análogos de HepD están bastante extendidos en invertebrados, peces, serpientes, etc.

    Los virus son `` mucho más desagradables '' que los viroides en ese aspecto de replicación porque

    Los virus de ARN de cadena positiva se replican mediante el uso de ARN polimerasas dependientes de ARN (RdRP) codificadas por virus que proporcionan una función de replicación directa de ARN a ARN que no se encuentra en las células hospedadoras.

    Algunas investigaciones recientes sugieren que los RdRP se han perdido de forma independiente en muchos clados de animales. Irónicamente, las funciones de estos RdRP del (antiguo) huésped era [muy probable] que proporcionaran un mecanismo antivírico a través del silenciamiento del ARN (consulte la [sección] a continuación para obtener más detalles), pero la evolución ha proporcionado mecanismos alternativos del huésped para producir el mismo.

    Si bien es posible reconocer el [núcleo de los] RdRP virales en el software, no está claro ni se sabe cómo traducir esto en una estrategia antiviral general, hasta donde yo sé, debido a su variación bastante sustancial. (En general, no es suficiente conocer la secuencia genética que codifica la RdRP de algunos virus para incluso seleccionar fármacos inhibidores para detectarla, además, se debe conocer la estructura cristalina del complejo RdRP de ese virus).

    Si tiene curiosidad sobre la defensa antiviral `` intracelular '' (es decir, basada en ARN). existen mecanismos como ese, pero son sustancialmente más complicados (que lo que sugieres), y se basan en cambio en el silenciamiento del ARN:

    En la inmunidad antiviral basada en ARN eucariota, el ARN de doble hebra viral se reconoce como un patrón molecular asociado a patógenos y se procesa en pequeños ARN interferentes (ARNip) por la ribonucleasa Dicer del hospedador. Después de la amplificación por ARN polimerasas dependientes de ARN del hospedador en algunos casos, estos ARNip derivados de virus guían la inmunidad antiviral específica a través de la interferencia del ARN y los mecanismos efectores de silenciamiento del ARN relacionados.

    Pasos clave en la inmunidad antiviral basada en ARN inducida en Drosophila melanogaster por la infección de virus de ARN de cadena positiva, como el virus de la casa del rebaño. Después de la entrada y la eliminación de los viriones del virus de la casa del rebaño (FHV), el ARN genómico de hebra positiva ((+) ARN) sirve como ARNm para la traducción de la ARN polimerasa dependiente del ARN viral (RdRP) y como plantilla para la síntesis de ARN antigenómico de cadena negativa ((-) ARN). La producción preferencial de ARN (+) por la RdRP viral se logra mediante múltiples rondas de iniciación de la síntesis de ARN desde el extremo 3ʹ del ARN poco abundante (-). El ARN bicatenario resultante (dsRNA) formado entre el ARN (+) de la progenie naciente 5ʹ-terminal y la plantilla (-) ARN es reconocido por Dicer 2 (DCR2) y escindido en pequeños ARN interferentes (ARNip), lo que desencadena ARN- inmunidad antiviral basada. Los ARNip virales se ensamblan con Argonaute 2 (AGO2) en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), se metilan en el extremo 3ʹ (representado por un círculo negro) por HEN1 y se usan para guiar la eliminación específica de ARN de FHV. Como contradefensa, el FHV codifica un supresor viral del silenciamiento del ARN, la proteína B2, que se dirige a dos pasos en esta vía inmune: inhibición de la producción de ARNip viral al unirse a RdRP viral y al precursor de ARNdc viral, y secuestro de ARNip viral por unión de ARNip dúplex. Loqs-PD, PD de isoforma locuaz.

    Y sí, la RdRP de los virus (la parte más importante de la máquina autocopiadora con la que vienen) es un objetivo importante de los medicamentos, p. Ej.

    Los CoV emplean una maquinaria de replicación / transcripción de múltiples subunidades. Un conjunto de proteínas no estructurales (nsp) producidas como productos de escisión de las poliproteínas virales ORF1a y ORF1ab (5) se ensamblan para facilitar la replicación y transcripción viral. Un componente clave, la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp, también conocida como nsp12), cataliza la síntesis de ARN viral y, por lo tanto, desempeña un papel central en el ciclo de replicación y transcripción del virus COVID-19, posiblemente con la ayuda de nsp7 y nsp8 como cofactores (6). Por lo tanto, Nsp12 se considera un objetivo principal para los inhibidores antivirales análogos de nucleótidos como el remdesivir, que muestra potencial para el tratamiento de infecciones virales COVID-19 (7, 8). [. ]

    La eficacia de los análogos de nucleótidos que terminan la cadena requiere que las RdRps virales reconozcan e incorporen con éxito la forma activa de los inhibidores en la cadena de ARN en crecimiento.


    Un nuevo descubrimiento muestra que las células humanas pueden escribir secuencias de ARN en el ADN: desafía el principio central de la biología

    Las células contienen maquinaria que duplica el ADN en un nuevo conjunto que entra en una célula recién formada. Esa misma clase de máquinas, llamadas polimerasas, también construyen mensajes de ARN, que son como notas copiadas del depósito central de ADN de recetas, para que puedan leerse de manera más eficiente en proteínas.Pero se pensaba que las polimerasas solo funcionaban en una dirección del ADN en ADN o ARN. Esto evita que los mensajes de ARN se vuelvan a escribir en el libro de recetas maestro de ADN genómico. Ahora, los investigadores de la Universidad Thomas Jefferson proporcionan la primera evidencia de que los segmentos de ARN se pueden volver a escribir en el ADN, lo que potencialmente desafía el dogma central en biología y podría tener amplias implicaciones que afectan a muchos campos de la biología.

    & # 8220Este trabajo abre la puerta a muchos otros estudios que nos ayudarán a comprender la importancia de tener un mecanismo para convertir los mensajes de ARN en ADN en nuestras propias células & # 8221, dice Richard Pomerantz, PhD, profesor asociado de bioquímica y biología molecular en Universidad Thomas Jefferson. & # 8220La realidad de que una polimerasa humana puede hacer esto con alta eficiencia, plantea muchas preguntas. & # 8221 Por ejemplo, este hallazgo sugiere que los mensajes de ARN pueden usarse como plantillas para reparar o reescribir el ADN genómico.

    El trabajo fue publicado el 11 de junio de 2021 en la revista Avances científicos.

    Junto con el primer autor Gurushankar Chandramouly y otros colaboradores, el equipo del Dr. Pomerantz comenzó investigando una polimerasa muy inusual, llamada polimerasa theta. De las 14 ADN polimerasas en células de mamíferos, solo tres hacen la mayor parte del trabajo de duplicar todo el genoma para prepararlo para la división celular. Los 11 restantes están involucrados principalmente en la detección y reparación cuando hay una rotura o error en las hebras de ADN. La polimerasa theta repara el ADN, pero es muy propensa a errores y comete muchos errores o mutaciones. Por lo tanto, los investigadores notaron que algunas de las cualidades de la polimerasa theta & # 8217s & # 8220bad & # 8221 eran las que compartía con otra máquina celular, aunque una más común en los virus: la transcriptasa inversa. Al igual que Pol theta, la transcriptasa inversa del VIH actúa como una ADN polimerasa, pero también puede unirse al ARN y leer el ARN en una cadena de ADN.

    En una serie de elegantes experimentos, los investigadores probaron la polimerasa theta contra la transcriptasa inversa del VIH, que es una de las mejor estudiadas de su tipo. Demostraron que la polimerasa theta era capaz de convertir mensajes de ARN en ADN, lo que hizo tan bien como la transcriptasa inversa del VIH, y que en realidad hizo un mejor trabajo que al duplicar ADN en ADN. La polimerasa theta fue más eficiente e introdujo menos errores al usar una plantilla de ARN para escribir nuevos mensajes de ADN que al duplicar ADN en ADN, lo que sugiere que esta función podría ser su propósito principal en la célula.

    El grupo colaboró ​​con el laboratorio del Dr. Xiaojiang S. Chen & # 8217 en la USC y utilizó cristalografía de rayos X para definir la estructura y descubrió que esta molécula podía cambiar de forma para acomodar la molécula de ARN más voluminosa, una hazaña única entre las polimerasas. .

    & # 8220Nuestra investigación sugiere que la función principal de la polimerasa theta # 8217 es actuar como una transcriptasa inversa & # 8221, dice el Dr. Pomerantz. & # 8220 En células sanas, el propósito de esta molécula puede ser hacia la reparación del ADN mediada por ARN. En las células enfermas, como las cancerosas, la polimerasa theta se expresa en gran medida y promueve el crecimiento de las células cancerosas y la resistencia a los medicamentos. Será emocionante comprender mejor cómo la actividad de la polimerasa theta & # 8217s en el ARN contribuye a la reparación del ADN y la proliferación de células cancerosas. & # 8221

    Referencia: & # 8220Polθ transcribe inversamente el ARN y promueve la reparación del ADN con plantilla de ARN & # 8221 por Gurushankar Chandramouly, Jiemin Zhao, Shane McDevitt, Timur Rusanov, Trung Hoang, Nikita Borisonnik, Taylor Treddinick, Felicia Wednesday Lopezcolorado, Tatiana Kent, Labiba A. Siddique , Joseph Mallon, Jacklyn Huhn, Zainab Shoda, Ekaterina Kashkina, Alessandra Brambati, Jeremy M. Stark, Xiaojiang S. Chen y Richard T. Pomerantz, 11 de junio de 2021, Avances de la ciencia.
    DOI: 10.1126 / sciadv.abf1771

    Esta investigación fue apoyada por las subvenciones NIH 1R01GM130889-01 y 1R01GM137124-01, y R01CA197506 y R01CA240392. Esta investigación también fue financiada en parte por una subvención de la Tower Cancer Research Foundation. Los autores reportan ningún conflicto de intereses.


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    1 Introducción y perspectiva histórica

    Los genomas eucariotas son complejos (hasta 25 000 loci genéticos en humanos) y están organizados dentro de estructuras de nucleoproteínas compactas (cromatina). Los mecanismos por los que se activan los genes individuales son de gran interés e importancia fisiológica, y los estudios realizados durante los últimos 35 años han revelado varios niveles de control [1].

    En primer lugar, los eucariotas contienen tres clases funcionalmente distintas de polimerasas de ARN nucleares [2] que transcriben selectivamente grandes genes de ARN ribosómico (ARN polimerasa I), genes codificadores de proteínas y algunos genes de ARN estructural pequeños (ARN polimerasa II) y ARNt, ARN 5S y otros pequeños. genes de ARN estructural (ARN polimerasa III) [3, 4]. Estas especificidades se reflejan en las composiciones de subunidades estructuralmente distintas de las tres ARN polimerasas [5], que contienen tanto subunidades comunes como subunidades únicas relacionadas con las de la ARN polimerasa bacteriana [6], y permiten la regulación global independiente de las principales clases de ARN.

    En segundo lugar, las células eucariotas contienen factores de iniciación generales específicos de la ARN polimerasa que, a pesar de la complejidad estructural de las enzimas (14, 12 y 17 subunidades en las ARN polimerasas I, II y III, respectivamente), son necesarios para el inicio de la transcripción precisa en el promotor central correspondiente. elementos por ARN polimerasas purificadas [7-11]. Ahora se sabe que estos factores incluyen TFIIIC y TFIIIB para la ARN polimerasa III [12] TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH para la ARN polimerasa II [13] y varios factores para la ARN polimerasa I [14]. Tras la identificación de los factores de reconocimiento del promotor central (TFIIIC para promotores de clase III y TFIID para promotores de clase II), los estudios mecanicistas revelaron vías para el ensamblaje ordenado de factores de iniciación y ARN polimerasas en los correspondientes complejos de preiniciación (PIC) [15-18] (Figs. 1). , izquierda y 2, Figs.1, izquierda y 2, derecha). La complejidad estructural de los complejos básicos de preiniciación (polipéptidos ∼25 y 44, respectivamente, para las ARN polimerasas III y II) es notable y una variedad de análisis bioquímicos y genéticos han proporcionado muchos detalles sobre la estructura y función de los polipéptidos individuales durante la formación de PIC. y durante los sucesivos eventos de iniciación y post-iniciación de la transcripción [12-14]. En el caso de la ARN polimerasa II, estudios estructurales de TBP-TATA y complejos de orden superior [19] y de la propia ARN polimerasa II [6, 20] han proporcionado conocimientos adicionales sobre la formación de PIC y la función de la ARN polimerasa.

    Dado que las ARN polimerasas y los factores de iniciación generales son los objetivos finales de los factores reguladores, estas complejas vías de ensamblaje ofrecen muchos puntos para las interacciones reguladoras. En este sentido, es importante señalar que, si bien las ARN polimerasas purificadas y los factores de iniciación general correspondientes (que comprenden la maquinaria de transcripción basal) tienen una capacidad intrínseca para transcribir con precisión las plantillas de ADN a través de elementos promotores centrales, lo que permite dilucidar los mecanismos fundamentales de transcripción. estas actividades generalmente se suprimen en la célula por el empaquetamiento de ADN dentro de la cromatina y por cofactores negativos que interfieren directamente con la función de los factores de transcripción basales (Fig. 3). Como se analiza a continuación, esto impone requisitos para los activadores de la transcripción y los cofactores correspondientes que actúan de una manera específica del gen tanto para revertir la represión (anti-represión) como para efectuar una activación neta por encima de la actividad intrínseca de la maquinaria de transcripción basal (Fig.3 ).

    En tercer lugar, los eucariotas contienen diversos factores reguladores transcripcionales de unión a ADN específicos de secuencia que facilitan la función de la ARN polimerasa en los genes diana correspondientes. El TFIIIA específico del gen 5S fue el primero de ellos en ser identificado como tal, purificado y clonado [21, 22], y también representa el prototipo de proteína de dedo de zinc [23]. [Las proteínas de dedo de zinc son las más comunes de las aproximadamente 2500 proteínas reguladoras de unión al ADN que se presumen en el genoma humano y los estudios de su mecanismo de reconocimiento de ADN han permitido el diseño de nuevas proteínas dirigidas selectivas a genes [24]]. Mecánicamente, se demostró que TFIIIA facilita la transcripción del gen 5S por la ARN polimerasa III a través de interacciones con TFIIIC, que de otra manera no se une al promotor 5S, lo que a su vez facilita el reclutamiento de TFIIIB y ARN polimerasa III [15] (Fig. 1, derecha) . Aunque distinto del mecanismo de activación en procariotas, que implica interacciones directas activador-ARN polimerasa [25], este mecanismo (que implica efectos indirectos sobre la ARN polimerasa) ha demostrado ser general en eucariotas y permite entradas reguladoras adicionales. Siguiendo el paradigma establecido por TFIIIA para eucariotas, se han identificado y caracterizado tanto estructuralmente como funcionalmente un gran número de factores reguladores de unión a ADN específicos de secuencia, a menudo con dominios distintos de unión y activación (o represión) de ADN. La gran mayoría de estos están implicados en la regulación del gran grupo de genes codificadores de proteínas transcritos por la ARN polimerasa II.

    En cuarto lugar, los factores de unión al ADN que regulan la transcripción de genes codificantes de proteínas actúan junto con un grupo en expansión de cofactores que actúan mediante modificaciones de la estructura de la cromatina o, más directamente, para regular la formación o función (inicio o elongación de la transcripción) de la complejo de preiniciación (Fig. 2). Los requisitos para los cofactores involucrados más directamente en la transcripción [27] son ​​algo sorprendentes en vista de la especificidad intrínseca de los diversos factores reguladores de unión al ADN, la complejidad estructural de su objetivo final (la maquinaria de transcripción basal) y las interacciones documentadas entre factores reguladores. y componentes de la maquinaria de transcripción basal [13, 28]. Sin embargo, esta capa adicional de complejidad permite nuevamente una variedad de nuevos mecanismos reguladores. Los coactivadores transcripcionales seleccionados son el tema principal de esta minireview y se analizan más adelante.


    Materiales y métodos

    Preparación de la muestra.

    Los oligonucleótidos usados ​​para la formación del complejo de elongación y la amplificación por PCR de las plantillas de transcripción se dan en la Tabla S2. Las plantillas se prepararon mediante reacciones de PCR usando un cebador con un éster NHS de digoxigenina 5 '(Dig) y el otro con un sitio de enzima de restricción 5' como se indica en el nombre del cebador. Las plantillas de PCR eran preparaciones genómicas de Saccharomyces cerevisiae (Rico en AT), bacteriófago lambda (Random, New England Biolabs) y Myxococcus xanthus (Rico en GC, cortesía de D. Zusman, Universidad de California, Berkeley, CA). Después de la purificación de la columna, los productos de la PCR se digirieron usando la enzima de restricción indicada en el nombre del cebador correspondiente y luego se purificaron de nuevo en la columna.

    La preparación de complejos de elongación (CE) estables y su ligación al ADN molde fue similar a la descrita previamente (5, 29). Las CE se crearon hibridando los oligonucleótidos TDS y RNA9, seguido de la adición de la RNA polimerasa biotinilada y luego el oligonucleótido NDS. A continuación, las CE se ligaron a los productos de PCR descritos anteriormente, dando como resultado CE ligadas de 4137 pb (rico en AT), 5017 pb (aleatorio) y 4240 pb (rico en GC).

    Los complejos de elongación ligados se incubaron con perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina de 2,1 µm (Spherotech). Las polimerasas se estancaron mediante la adición de ATP, CTP y GTP hasta una concentración final de 10 µM y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min. Esta reacción luego se diluyó 1 ~ 100 en TB40 (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9, KCl 40 mM, MgCl 10 mM2, DTT 10 mM) y se introduce en el aparato de fluídica de la cámara óptica. Una vez que una sola perla quedó atrapada en una de las trampas ópticas, se introdujeron perlas de poliestireno recubiertas con IgG reticuladas anti-digoxigenina (Roche Diagnostics) de 2,1 μm (Spherotech) en la cámara óptica y se atraparon en la otra trampa. A continuación, estas dos perlas se frotaron juntas moviendo la posición de una de las trampas ópticas, hasta que se detectó un aumento en la fuerza tras la separación de las perlas. Las ataduras simples se distinguieron por la confirmación de que la distancia entre las perlas correspondía a la longitud de la atadura de la plantilla. Una vez que se confirmaron las ataduras simples, se reinició la transcripción haciendo fluir TB40 suplementado con NTP 1 mM y pirofosfato 1 μM en la cámara.

    Expresión / Purificación de Rpo41 biotinilado.

    Se insertó una secuencia de ADN que codifica la etiqueta de biotinilación de 13 aminoácidos (GLNDIFEAQ K IEWHE, el sitio de biotinilación está subrayado) en el sitio StuI del plásmido de expresión de Rpo41 pProExHtb-RPO41 (45) para producir el plásmido pProExHtb-Avi-RPO41. Este plásmido se transformó en la cepa AVB100 de expresión de BirA (biotina ligasa) (Avidity, Inc.) junto con el plásmido CodonPlus (Stratagene) y luego se expresó como se describió anteriormente (45), excepto con inducción adicional de BirA según las instrucciones del fabricante. La purificación fue similar a la descrita previamente (45) excepto por un paso cromatográfico adicional usando la columna SoftLink Avidin (Promega). Todos los pasos cromatográficos utilizaron tampón TB300 (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9, KCl 300 mM, MgCl 10 mM2, DTT 10 mM, glicerol al 10%) con biotina 5 mM para elución de la columna de avidina e imidazol 500 mM para elución de la columna de níquel. La proteína purificada se dializó con TB300, se congeló rápidamente usando nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC.

    Adquisición / Análisis de datos.

    Los métodos de instrumentación y adquisición de datos fueron los descritos anteriormente (5, 21). Los datos se tomaron a 2000 Hz. Los datos de fuerza y ​​posición de las trazas que contienen la transcripción activa se promediaron mediante diezmado a 50 Hz y luego se suavizaron utilizando un filtro Savitsky-Golay de segundo orden con una constante de tiempo de 1 s. Debido a que el método de las pinzas ópticas solo devuelve cambios en la extensión, detuvimos las polimerasas en un sitio definido en el ADN para calcular la extensión inicial de la atadura.Calculamos la longitud del contorno del ADN en momentos posteriores utilizando la extensión de extremo a extremo actualizada de la correa y la fuerza aplicada utilizando el modelo de cadena en forma de gusano de las estadísticas de polímeros (22). Luego, convertimos los cambios en la distancia entre las perlas en el número de pares de bases transcritos por la enzima.

    Métodos de estadística.

    Debido a errores inherentes a los algoritmos de selección de pausas (ver Texto SI), se utilizó un algoritmo estadístico para la determinación de la velocidad sin pausas. Este método se basa en la noción de que la pausa es un proceso de difusión y, por lo tanto, las velocidades durante una pausa surgen del movimiento browniano unidimensional de la polimerasa que se mueve a lo largo de la plantilla. En consecuencia, las velocidades de las polimerasas observadas durante las pausas deben tener una distribución gaussiana y centrarse en la velocidad cero. Se compuso un histograma de todas las velocidades para un conjunto de datos dado y se ajustó un gaussiano centrado en cero en los contenedores que contenían velocidades negativas. Este ajuste (ver línea continua amarilla en la Fig. S4) se extrapoló luego sobre todos los datos (línea amarilla discontinua) y se restó de los datos. Las velocidades restantes corresponden a los datos limpios de pausas (es decir, la distribución de velocidad sin pausas). El promedio de estos datos sobrantes es la velocidad sin pausas del conjunto de datos. Los errores son la desviación estándar de las medias determinadas al muestrear las trazas con reemplazo (bootstrapping).

    Se utilizó un método de selección de pausas comúnmente utilizado en el campo de la transcripción de una sola molécula para el análisis de pausas (5, 29, 46), y se describe en detalle en Texto SI. La distribución de la duración de la pausa se ajustó a la distribución teórica descrita por la Ec. 1 realizando una prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos muestras entre las dos distribuciones, manteniendo solo aquellas que se consideraron estadísticamente indistinguibles. Esto se hizo dentro de los límites determinados ajustando las duraciones medias teóricas de las pausas y las densidades de las pausas con las definidas por las medias observadas más y menos los errores estándar observados (ver Texto SI).

    Simulación de plegado cotranscripcional.

    Los primeros 400 pb de las secuencias molde utilizadas en este estudio se introdujeron en Kinefold, una simulación de plegamiento de ARN cotranscripcional (35). Cada simulación se ejecutó en modo por lotes utilizando 56 y 40 ms como tiempo de adición de nucleótidos para Pol II y Rpo41, respectivamente (correspondiente a una velocidad sin pausa de 18 y 25 pb / s, respectivamente). Estas simulaciones se repitieron con al menos tres semillas diferentes para cada combinación de enzima / plantilla. La diferencia en la energía de plegamiento simulada media fue inferior al 5% de su valor medio para todas las semillas y todas las plantillas, y varió menos del 1% entre las enzimas a pesar de la diferencia en los tiempos de adición de nucleótidos. Estas energías se corrigieron para la concentración de sal (47) y se denotaron ΔGRAMOsim en el texto principal. Dos de las estructuras de la plantilla rica en GC fueron muy sensibles a esta corrección de sal, lo que condujo a un rango significativo en las barreras de energía simuladas corregidas para esa plantilla.


    Ver el vídeo: Regulación de la transcripción. Khan Academy en Español (Mayo 2022).


Comentarios:

  1. Ducage

    Has dado en el clavo. Hay algo en esto y una buena idea, estoy de acuerdo contigo.

  2. Sagar

    Pido disculpas, pero, en mi opinión, no tienes razón. Estoy seguro. Lo sugiero que debatir. Escríbeme en PM, nos comunicaremos.

  3. Barclay

    Bien hecho, qué palabras necesarias ..., la notable idea

  4. Atkinson

    ¡Hola a todos!

  5. Hungas

    Soy definitivo, lo siento, pero no podrías dar más información.

  6. Chetwin

    Creo que estás cometiendo un error. Puedo defender mi posición. Envíeme un correo electrónico a PM, hablaremos.



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